为什么提取质粒测出来OD值了,跑胶没有条带?
来源:学生作业帮 编辑:搜搜做题作业网作业帮 分类:综合作业 时间:2024/07/01 04:14:10
为什么提取质粒测出来OD值了,跑胶没有条带?
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只要制备胶等过程都没问题,marker也跑出条带了,那这种情况最有可能的原因还是质粒的浓度过低.所以,虽然OD值可测出来,但胶显示不出来,我就遇到过这样的情况,还算很普通的现象.下次再加大菌量就行.
再问: 我们是自己配的试剂,没有用试剂盒,那你一般跑胶上样多少体系?
再答: 一般高拷贝质粒一般上样5ul就足够了,在加1ul6*loading buffer.量够的话,1~3ul都能跑出条带。我觉得与上样体系关系不大,具体的我在举几种情况吧。 1. 如果你加大菌量还没提出来,也许你的质粒是低拷贝的质粒。一般高拷贝质粒象PUC质粒通常5mL菌就差不多能提出来,但像PBI121这样低拷贝的质粒就需要加大菌量。菌量多大呢?至少20mL试试吧。像我现在因为质粒用量大,每次一提就是80mL菌量呢。当然一定注意菌量加大,溶液I、II、III一定要相应增大量。 建议:提质粒时,可以顺便提一个高拷贝的质粒作为对照,验证提取体系的试剂、操作等。 2. 如果对照质粒提出来了,而加大菌量还没提出来,那么最有可能要从菌上入手。最好使用冻存的菌重新活化再试试。如果菌在冰箱中放的太久,不排除影响质粒的表达。还有就是细节的问题,比如菌培养的时间是不是超过18小时,已经到了菌生长的衰亡期,这会影响质粒的表达。甚至培养前加的抗生素过没过效。这些虽是细节,但会影响整个实验的成败。
再问: 我们是自己配的试剂,没有用试剂盒,那你一般跑胶上样多少体系?
再答: 一般高拷贝质粒一般上样5ul就足够了,在加1ul6*loading buffer.量够的话,1~3ul都能跑出条带。我觉得与上样体系关系不大,具体的我在举几种情况吧。 1. 如果你加大菌量还没提出来,也许你的质粒是低拷贝的质粒。一般高拷贝质粒象PUC质粒通常5mL菌就差不多能提出来,但像PBI121这样低拷贝的质粒就需要加大菌量。菌量多大呢?至少20mL试试吧。像我现在因为质粒用量大,每次一提就是80mL菌量呢。当然一定注意菌量加大,溶液I、II、III一定要相应增大量。 建议:提质粒时,可以顺便提一个高拷贝的质粒作为对照,验证提取体系的试剂、操作等。 2. 如果对照质粒提出来了,而加大菌量还没提出来,那么最有可能要从菌上入手。最好使用冻存的菌重新活化再试试。如果菌在冰箱中放的太久,不排除影响质粒的表达。还有就是细节的问题,比如菌培养的时间是不是超过18小时,已经到了菌生长的衰亡期,这会影响质粒的表达。甚至培养前加的抗生素过没过效。这些虽是细节,但会影响整个实验的成败。
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